INTRODUÇÃO

A indução da parada temporária do coração durante a cirurgia cardíaca é um procedimento relativamente comum que permite ao cirurgião realizar procedimentos em ambiente isento de sangue e movimento [1-3]. Um dos agentes cardioplégicos utilizados é a solução histidina-triptofano-cetoglutarato (HTK).

O HTK foi testado por Bretschneider et al. [4], na Alemanha, em 1975. Seu mecanismo de ação vem da ausência do cálcio, que evita seu influxo para o interior da célula pelos canais de cálcio tipo "L" na fase de platô do potencial de ação, inibindo a liberação de mais cálcio do retículo sarcoplasmático do miócito, resultando na inativação dos miofilamentos [5,6].

Esse mecanismo é complementado pela proteção celular dada pelos constituintes dessa solução, cujas funções principais incluem: 1- histidina: sistema tampão dependente de temperatura, inibidor de metaloproteinases de matriz e impermeante celular [7]; 2- triptofano: atua na manutenção da integridade da membrana celular [8] e, 3- cetoglutarato: melhora pressão máxima desenvolvida e evita aumento da fração MB da creatinofosfoquinase [8].

Segundo Pisarenko et al. [9], a substituição do alfacetoglutarato pelo glutamato traria algumas vantagens para o miócito: a diminuição do lactato e a elevação do pH na matriz mitocondrial, mesmo em isquemia, evitando a acidose intracelular e o edema, contribuindo para a manutenção do trifosfato de adenosina (ATP) intracelular, protegendo o miócito da lesão de isquemia-reperfusão.

Por sua vez, a redução da lesão de reperfusão provocaria diminuição da caspase [10-12] e da IL-8, devido à redução da apoptose e da necrose celular, respectivamente [13,14]. Entretanto, a diminuição da lesão de reperfusão pode não estar atuando sozinha em benefício ao miócito. Proteínas proliferativas, como o KI-67, poderiam voltar a serem codificadas, contribuindo para a redução da morte celular e mesmo formação de novas fibras miocárdicas [15,16].

Este trabalho objetiva avaliar solução de HTG como agente cardioplégico em coração isolado de ratos, considerando análise imuno-histoquímica dos marcadores caspase, IL-8 e KI-67.

MÉTODOS

Após aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (autorização número 015/2012), foram utilizados 20 ratos (10 para cada grupo), machos, raça Wistar, com peso médio de 280±29 gramas.

Todos os animais receberam cuidados conforme recomendações do Committee on Care and Use of Laboratory Animals - Institute of Laboratory Animal Resources (ILAR) - National Research Council, Estados Unidos [17].

Protocolo Experimental

Os animais foram anestesiados com injeção de 65 mg/kg intraperitoneal de pentobarbital sódico e receberam heparinização sistêmica IP (500 UI/kg). Após a abertura do tórax, foi realizada cardiectomia. Os corações receberam solução de Ringer lactato para "lavar" a árvore coronariana e, em seguida, solução cardioplégica conforme seu grupo.

Os corações nessa fase do experimento foram divididos em 2 grupos. No grupo 1, foi utilizada solução de HTK a 4ºC e, no grupo 2, solução de histidina-triptofano-glutamato (HTG) a 4ºC. A Tabela 1 apresenta a composição de cada uma das soluções. Em todos os casos, a infusão da cardioplegia foi feita em dose única de 40 ml/kg na raiz da aorta, seguida por imersão do órgão na mesma solução por 2 horas a 4ºC.

Após esse tempo, os corações foram colocados em sistema de Langendorff e perfundidos com solução tampão de Ringer Locke oxigenado, em normotermia e pressão constante de 100 cm H₂O, por método gravitacional durante 30 minutos. A drenagem do ventrículo direito foi realizada pela abertura da artéria pulmonar, sendo mantido intacto o átrio direito no intuito de preservar o nó sinusal [18].

Foram inseridos três fios de marca-passo epicárdico em pontos equidistantes dos ventrículos para documentação eletrocardiográfica dos eventos cardíacos. Foi anotado o tempo de início da fibrilação ventricular e o primeiro batimento cardíaco contado a partir do início da infusão da solução de Ringer Locke.

Após 30 minutos de infusão de Ringer Locke, o experimento foi descontinuado. Os corações foram retirados do sistema de Langendorff, sendo coletados fragmentos de ápice cardíaco, que foram armazenados em tubos estéril tipo Falcon contendo formol 10%, para posterior preparação histólogica e imuno-histoquímica.

Preparação histológica e técnica imuno-histoquímica

Inicialmente, o material foi incluído em parafina, procedimento que oferece resistência permitindo seu corte em espessura de 3 µm e colocados em lâminas silanizadas. A silanização das lâminas consistiu na preparação destas com um adesivo que fixa o fragmento às lâminas, impedindo seu descolamento durante o procedimento imuno-histoquímico. Para tanto, estas foram imersas em acetona PA (2 minutos), solução de silano 4% diluído com acetona (2 minutos) e novamente em acetona PA (4 a 5 mergulhos). A secagem das lâminas foi realizada na estufa a 60ºC.

O bloco foi preso ao micrótomo, a espessura do corte foi regulada para 3 µm e os cortes colocados em lâmina silanizada identificada e deixados na estufa a 60ºC por 24 horas. As lâminas passaram pelo processo de desparafinização em xilol, seguida por hidratação em álcool absoluto I, II e III, finalizando com seis mergulhos em água corrente, incubados com 3% de peróxido de hidrogênio por 30 minutos para o bloqueio da peroxidase endógena.

A recuperação antigênica foi realizada na panela a vapor com tampão específico para cada anticorpo por 30 minutos (Tabela 2). Em seguida, as lâminas foram encobertas com solução contendo soro fetal bovino (BSA) e incubadas com o anticorpo primário.

Após essa etapa, as lâminas foram lavadas em solução PBS por 15 minutos e incubadas com kit Starr Trek Universal HRP Detection (Biocare Medical^®), que consistiu no anticorpo secundário biotinilado por 1 hora e no complexo estreptavidina-peroxidase por 30 minutos, seguidas de lavagem com PBS por 15 minutos. A revelação foi feita com substrato cromógeno (Betazoidchromogen DAB) do kit Starr Trek Universal HRP Detection (Biocare Medical^®) de 2 a 5 minutos e a contracoloração com hematoxilina de Harrys por 40 segundos. Os tecidos foram desidratados em álcool em grau crescente e banhados no xilol antes da montagem das lâminas em meio ERV-MOUNT (Erviegas^®).

Os controles negativos das reações foram obtidos pela omissão do anticorpo primário. Foram utilizados tecido de tonsila para reações de KI-67 e caspase 3 e como controle positivo tecido de mama para reação de IL-8.

Quantificação da marcação imuno-histoquímica

As lâminas foram fotografadas e as enzimas quantificadas pelo software AxioVision no aumento de 40X do microscópio Axioskop 2 Zeiss. Para cada amostra, foram selecionadas três regiões do tecido cardíaco e 20 pontos das células miocárdicas foram marcados em cada região. Assim, foram analisados 60 pontos diferentes de cada amostra, obtendo a média da intensidade relativa de imunorreatividade. Os valores foram obtidos em unidades arbitrárias (UA). A densidade óptica média (DOM) foi obtida com a ajuda da fórmula:

DOM = 255 - UA

Essa fórmula demonstrou a intensidade da imunocoloração especificamente nas áreas imunorreativas.

Análise estatística

Os dados obtidos foram submetidos ao teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov e, subsequentemente, a análise paramétrica pelo teste t de Student não pareado ou não paramétrica pelo teste de Mann-Whitney, quando adequado, e teste exato de Fisher para dados categóricos. Os resultados foram expressos somente em média ± desvio padrão devido ao fato de todas as variáveis se comportarem como quantitativas contínuas com distribuição Gaussiana. Os valores de P foram apresentados, sendo que aqueles que foram menores que 0,05 foram considerados significantes. Utilizou-se o programa de cálculos estatísticos GraphPad Instat e Prism 6.0, ambos para Windows^®.

RESULTADOS

O peso médio dos animais foi 277,4±24,6 g (grupo 1) e 288±34,5 g (grupo 2), respectivamente, não havendo diferença significante entre os grupos (P=0,4396). Com relação ao volume médio de Ringer Locke coletado de seio coronário ao final de 30 minutos (363,1±177,3 ml e 277,4±33,7 ml, respectivamente), não houve diferença significante entre os grupos (P=0,1923).

Achados durante perfusão com solução cardioplégica e Ringer Locke

Todos os corações apresentaram perfusão adequada de cardioplegia e Ringer Locke, evidenciada pela coloração clara na parede ventricular. A frequência cardíaca média, após 5 minutos de perfusão (233±36 e 188±53,4 batimentos por minuto, respectivamente), apresentou diferença significante (P=0,0086). O tempo de início de fibrilação ventricular (49±28,2 e 45±17 segundos, respectivamente) e o tempo de primeiro batimento (153±78 e 117±96,8 segundos, respectivamente) não demonstraram diferença significante (P=0,5869 e P=0,187, respectivamente).

Achados imuno-histoquímicos

Após 2 horas de isquemia e 30 minutos de reperfusão, a atividade da caspase foi significativamente menor no grupo 2 (P<0,0001), a atividade de KI-67 foi maior no grupo 2 (P<0,0001) e a da IL-8 não foi diferente entre os grupos (Figura 1).

DISCUSSÃO

Isquemia miocárdica causa diversos efeitos cardíacos, tais como: diminui força de contração; aumenta pressão diastólica, indicando contratura das miofibrilas em condições isovolumétricas; provoca queda na fosfocreatina e ATP; diminui a contratura, glutamato e aspartato e; aumenta lactato, piruvato, alanina e succinato [9]. Segundo Pisarenko et al. [9], a adição de glutamato no perfusato mantém o ATP intracelular e diminui tanto o lactato quanto o piruvato, que contribuiriam para acidose. Esses efeitos contribuem para melhorar a função cardíaca na recuperação após isquemia. Nossos resultados demonstram comportamento semelhante nas duas soluções estudadas referentes ao tempo de fibrilação ventricular e tempo de primeiro batimento, entretanto foi melhor para grupo 2 para frequência cardíaca, que se encontrava mais baixa, o que pode ser correlacionado provavelmente com menor acidose do miócito.

Outro processo que está intrinsecamente relacionado com lesão isquemia-reperfusão é a apoptose [10,11], caracterizada por alterações morfológicas, como condensação da cromatina, fragmentação do núcleo e formação de "corpos apoptóticos". Essas mudanças são feitas por uma família de proteases denominadas caspases [12]. O grau de ativação das caspases é diretamente relacionado ao grau de apoptose, que desempenha fator crítico na recuperação da função cardíaca [13]. Nossos resultados demonstram atividade de caspase menor no grupo 2, sugerindo um potencial protetor para função miocárdica.

Em contraste com a apoptose, a necrose é um processo irreversível de morte celular em consequência à quebra na homeostase celular. Há ruptura da membrana celular, com extravasamento do citosol ao meio extracelular, marginação leucocitária e ativação da cascata inflamatória [13,14]. Anselmi et al. [14] descreveram pico da IL-8 em 35 minutos de reperfusão e da IL-6 em 75 minutos. Lee et al. [13] afirmaram que a solução de HTK inibe aumento das interleucinas. Assim, como nesta pesquisa não houve diferença significativa da IL-8 entre os grupos 1 e 2, podemos inferir que a proteção anti-inflamatória dada pela solução HTG não foi diferente daquela dada pela solução HTK.

Corações de mamíferos apresentam pequena capacidade proliferativa após o nascimento. Um dos marcadores utilizados para avaliar proliferação celular é o KI-67 [15]. Com esse marcador, Walsh et al. [16] demonstraram que 12% a 23% dos cardiomiócitos fetais de ratos apresentam atividade proliferativa, passando a 1% a 8% até o 7º dia e praticamente indetectável a partir do 14º dia. Em nosso estudo, houve aumento significativo do KI-67 no grupo 2, demonstrando atividade proliferativa precoce da solução HTG garantida já com 2 horas de isquemia. Associado a isso, Walsh et al. [16] também chamam a atenção da atividade do KI-67 também ser inversamente proporcional à apoptose, o que também é confirmado em nosso estudo, no qual a caspase é menor no grupo 2 que no 1. Entretanto, o aumento da atividade desse marcador é preocupante, pois já foi associado a mixomas [19,20] e sarcomas cardíacos [21].

Apesar dos resultados aqui obtidos serem concordantes com os da literatura, ainda não são definitivos em relação à substituição do alfacetoglutarato pelo glutamato. Análises quantitativas com ATP e outros marcadores nucleares para proliferação celular devem ser utilizados visando a uma conclusão mais abrangente e segura. Outro aspecto relevante é a concentração do glutamato. Teria o mesmo efeito protetor no coração se alterarmos sua concentração? Novos estudos ainda são necessários para responder essas questões.

CONCLUSÃO

A análise imuno-histoquímica da substituição do alfacetoglutarato pelo glutamato na cardioplegia com histidina e triptofano demonstrou que as células musculares cardíacas não apresentaram maior ocorrência de necrose, visto pela mensuração da IL-8, apresentaram menor ocorrência de apoptose, confirmado pelos valores mais baixos da caspase no grupo 1 e melhor atividade proliferativa, com valores maiores da KI-67 em relação ao grupo 1. Isso sugere que a solução HTG foi mais eficiente que a HTK na preservação dos cardiomiócitos dos corações de ratos.

REFERÊNCIAS

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Não houve suporte financeiro.

Papéis & responsabilidades dos autores

MABO: Desenho do estudo, realização dos experimentos, análise dos resultados e redação do manuscrito

LCF: Auxílio nas técnicas imuno-histoquímicas

DAPCZ: Auxílio nas técnicas imuno-histoquímicas

ACB: Participação na elaboração do texto final

CAS: Participação na elaboração do texto final

PHHB: Participação na elaboração texto final

OP: Revisão versão final

DMB: Desenho do estudo, análise dos resultados e redação do manuscrito

Article receive on quinta-feira, 17 de outubro de 2013