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ARTIGO ORIGINAL

Efeitos da radiação gama no comportamento mecânico e na calcificação do pericárdio bovino fixado com glutaraldeído

José Augusto BAUCIAI; Ricardo Mendes LEAL NETOII; José Roberto ROGEROII; Nanci do NASCIMENTOII; Carmem Aparecida Cruz ReyesIII

DOI: 10.1590/S0102-76382007000100014

RESUMO

Objetivo: Avaliar o comportamento mecânico e os efeitos no processo de calcificação pós-implante do pericárdio bovino tratado com glutaraldeído submetido a várias doses de radiação gama. Método: Pericárdios bovinos fixados com glutaraldeído foram submetidos a radiação gama, nas doses de 0 a 10000 Gy. Seis amostras de cada grupo foram avaliadas pela microscopia óptica, determinação da temperatura de desnaturação do colágeno e ensaio mecânico de tração e implantadas subcutaneamente em ratos. Após quatro meses do implante, as amostras foram explantadas e o conteúdo de Ca2+ determinado pela espectrometria de absorção atômica. Resultados: Níveis de Ca2+ (em µg/mg): 0 Gy (controle) - 194,45; 50 Gy - 154,64; 100 Gy - 169,37; 200 Gy - 163,64; 500 Gy - 199,89; 1000 Gy - 184,02; 2000 Gy - 198,95; 5000 Gy - 227,95 e 10000 Gy - 362,62. Houve alteração significativa no comportamento mecânico do tecido irradiado, quando comparado ao grupo controle, mesmo com o emprego de baixas doses de radiação. Conclusão: O emprego da radiação gama no pericárdio bovino tratado com glutaraldeído não reduziu os níveis de Ca2+ em implantes subcutâneos em ratos por quatro meses e promoveu alteração significativa no comportamento mecânico do tecido, com redução na sua resistência, quando comparados ao grupo controle.

ABSTRACT

Objective: To evaluate the effect of gamma irradiation on glutaraldehyde-fixed bovine pericardium. Method: Glutaraldehyde-fixed bovine pericardium was exposed to gamma radiation (doses from 0 to 10000 Gy). Six samples from each of nine groups were evaluated by optic microscopy, and shrinking and mechanical tests and the denaturation temperature was determined. Additionally, they were subcutaneously implanted in rats and after four months they were explanted and Ca2+ levels measured by atomic absorption spectroscopy. Results: The Ca2+ levels were (in µg/mg): control (0 Gy) - 194.45; 50 Gy - 154.64; 100 Gy - 169.37; 200 Gy - 163.64; 500 Gy - 199.89; 1000 Gy - 184.02; 2000 Gy - 198.95; 5000 Gy - 227.95; 10000 Gy - 362.62. Gamma irradiation caused a significant effect on the biomechanical properties of the tissue. Conclusion: Exposure to gamma irradiation did not reduce Ca2+ levels and caused a significant reduction in the tensile strength of glutaraldehyde-fixed bovine pericardium.
INTRODUÇÃO

Tecidos colágenos tratados com o glutaraldeído têm sido empregados na confecção de biopróteses cardíacas, entretanto, a calcificação tardia pós-implante constitui a causa predominante de sua falência.

O tratamento com o glutaraldeído não elimina todas as atividades metabólicas dos tecidos colágenos. Foi demonstrada uma retenção na atividade hidrolítica da enzima fosfatase alcalina da ordem de 10 a 75% [1], sugerindo o seu envolvimento no processo de calcificação.

A calcificação é um evento de múltiplas causas, onde fatores do hospedeiro, do implante e biomecânicos estão envolvidos, iniciando-se com a formação de cristais de hidroxiapatita nas membranas celulares, que contêm altas concentrações de fosfolipídeos e elevada atividade da enzima fosfatase alcalina [2].

O estudo da calcificação e de meios para controlá-la ou postergá-la tem sido o foco de pesquisas, nas últimas duas décadas [3-7], muitas das quais atuando na redução da atividade enzimática da fosfatase alcalina por extração ou inibição [8-15].

Não existem relatos na literatura sobre os efeitos da radiação gama na calcificação do pericárdio bovino fixado com glutaraldeído, entretanto, alterações na conformação espacial da fosfatase alcalina induzidas pela radiação gama podem, em teoria, inibir a sua atividade enzimática e interferir no processo de calcificação.

O objetivo da presente investigação é avaliar o comportamento mecânico e os efeitos no processo de calcificação pós-implante do pericárdio bovino tratado com glutaraldeído, submetido a várias doses de radiação gama, comparando-os com o grupo controle não exposto à radiação.

MÉTODO

O pericárdio bovino foi coletado em frigorífico submetido à fiscalização do Departamento de Inspeção Federal do Ministério da Agricultura e Departamento de Vigilância Sanitária da Secretaria de Saúde Estadual, imediatamente após o abate do animal, sendo selecionados, após uma limpeza inicial com retirada do tecido gorduroso peri-pericárdico, e transportados em solução salina de NaCl 0,9% e MgSO4 1,0 g, pH 7,4 a 4oC. No laboratório, o pericárdio bovino foi submetido a uma nova limpeza, selecionando-se 4 unidades com espessura e homogeneidade similares. Estes pericárdios foram emoldurados em suportes ovais plásticos de 15,0 x 12,0 cm.

Os pericárdios foram submetidos à fixação pelo glutaraldeído em solução aquosa a 0,5%, tamponado a pH 7,4 (tampão fosfato) e mantidos ao abrigo da luz, por 10 dias, a 4ºC, com trocas da solução no 1o, 4o e 7o dias. Ao término do processo de fixação, os pericárdios foram retirados dos suportes plásticos, lavados em solução salina de NaCl 0,9%, sob agitação contínua, com várias trocas da solução, divididos em seis grupos e submetidos à ação da radiação gama. Grupo 1: 0 Gy - controle, grupo 2: 50 Gy, grupo 3: 100 Gy, grupo 4: 200 Gy, grupo 5: 500 Gy, grupo 6: 1000 Gy, grupo 7: 2000 Gy, grupo 8: 5000 Gy e grupo 9: 10000 Gy.

Determinação da radiosensibilidade da enzima fosfatase alcalina

Embora a fosfatase alcalina com atividade hidrolítica possa ser extraída de forma reprodutível no pericárdio bovino fresco, ela não pode ser detectada quimicamente após fixação com o glutaraldeído por 24 horas [16].

Tendo em vista essa dificuldade técnica, optou-se por avaliar a radiosensibilidade da fosfatase alcalina in vitro, em uma solução aquosa da enzima pura, com atividade conhecida e a atividade remanescente mensurada frente a várias doses de radiação gama. Esta solução foi fracionada em nove alíquotas, acondicionadas em recipientes de vidro e submetidas à radiação gama em gama-câmara (fonte: Co60, atividade de 22413,1 x 1010 Bq e taxa de dose de 5010 Gy/h), nas seguintes doses contínuas: 0 Gy, 50 Gy, 100 Gy, 200 Gy, 500 Gy, 1000 Gy, 2000 Gy, 5000 Gy e 10000 Gy.

A atividade resultante da fosfatase alcalina em cada alíquota foi determinada pela formação do p-nitrofenol, com leitura da absorbância em espectrofotômetro, no comprimento de onda de 450 nm.

Determinação da temperatura de encolhimento

A temperatura de encolhimento abrupto das amostras, que é temperatura requerida para liberar as pontes de H da tripla hélice e modificar aleatoriamente a configuração do colágeno, foi o método empregado para a determinação do grau de estabilização do tecido após a fixação.

Cinco amostras de cada grupo, cortadas em tiras de 3,0 x 1,0 cm e imersas em banho-maria com solução salina de NaCl 0,9%, foram dispostas de modo a apresentarem uma de suas extremidades fixa no fundo do aparelho e a outra submetida a uma tração de 0,5 g. A temperatura do banho-maria foi elevada progressivamente, na razão de 4 ºC/min, até ocorrer o encolhimento abrupto da amostra.

Ensaio de tração

Cinco amostras de cada grupo foram submetidas ao ensaio de tração, em máquina de ensaio INSTRON 4400R, para determinação do alongamento e tensão.

As amostras foram cortadas em tiras de 3,0 x 0,4 cm, presas às pinças do aparelho e mantidas imersas em solução salina de NaCl 0,9%, à temperatura constante de 37ºC. Uma força inicial de 0,5 g foi aplicada e o ensaio foi realizado com velocidade de deslocamento constante de 10 mm/min até o rompimento da amostra.

Foram registradas curvas de força x deslocamento. Para o cálculo da tensão de tração, considerou-se a área inicial (largura x espessura) das amostras e o alongamento foi determinado pelo deslocamento das pinças do aparelho. Para determinar a espessura, as amostras foram colocadas entre duas lamínulas de vidro e a medição foi feita com paquímetro digital.

O alongamento foi medido até o ponto equivalente à tensão máxima suportada pelo tecido e a resistência mecânica definida como sendo o valor de tensão máxima suportada.

A curva selecionada para análise como representativa de cada grupo foi a que mais se aproximou do valor médio das tensões máximas.

Controle da esterilidade

A esterilidade das amostras foi assegurada por meio de culturas em estufa a 25ºC, por 14 dias, empregando-se como meios de cultura o Tioglicolato e o Sabouraud.

Determinação quantitativa de Ca2+

Cinco amostras de cada grupo foram desidratadas em estufa a 50ºC e mineralizadas em forno de Mufla a 800ºC. As amostras mineralizadas foram dissolvidas em HNO3 2,5 M e enviadas para a determinação quantitativa do Ca2+ pela espectroscopia de absorção atômica com espectrômetro Perkin Elmer, modelo Analyst 100, no comprimento de onda de 422,7 nm. A curva de calibração foi obtida usando-se solução padrão Perkin Elmer de 1,000 mg/L, com adição de cloreto de lantânio a 1%. A quantidade total de Ca2+ foi expressa em mg por mg de tecido seco.

Implante em ratos

Vinte e sete ratos fêmeas Wistar, com idade média de 30 dias foram utilizados no experimento. Os animais foram obtidos no biotério do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares e a pesquisa aprovada pela Comissão de Ética em Pesquisa da instituição (protocolo 001/2005 - IPEN). As normas estabelecidas no Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e os princípios éticos na experimentação animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) foram respeitados.

Os ratos foram anestesiados, tricotomizados e amostras do tecido, medindo 2,0 x 1,5 cm, foram implantadas em duas lojas subcutâneas dissecadas na região dorsal, perfazendo um total de 6 amostras de cada grupo. Decorridos quatro meses, as amostras foram explantadas, dissecadas para retirada do tecido do hospedeiro, e lavadas em solução de NaCl 0,9%. Cinco amostras de cada grupo foram encaminhadas para determinação do conteúdo de Ca2+ e a remanescente foi avaliada pela microscópica óptica, empregando-se a coloração de vonKossa.

Análise estatística

Os dados foram calculados em média ± desvio-padrão. As diferenças entre as médias dos grupos foram testadas empregando-se o teste t Student. Os resultados foram considerados significativos quando p < 0,05.


RESULTADOS

Radiosensibilidade da enzima fosfatase alcalina

A inibição da atividade enzimática foi crescente com o incremento da dose de radiação gama empregada, obtendo-se uma redução superior a 98% da sua atividade inicial, com dose igual ou superior a 5000 Gy (Figura 1).


Fig. 1 - Micrografias das amostras de pericárdio bovino explantadas. A. 0 Gy; B. 50 Gy; C. 100 Gy; D. 200 Gy; E. 500 Gy; F. 1000 Gy; G. 2000 Gy; H. 5000 Gy; I. 10000 Gy - Von Kossa, Aumento 80 X.


Microscopia óptica

Nas amostras irradiadas pré-implante, observou-se a preservação de uma estrutura colágena homogênea. Nas amostras explantadas, houve intensa calcificação em todos os grupos (Figura 2).


Fig. 2 - Curvas de tensão x deformação obtidas em função da dose de radiação gama empregada (0 Gy = controle).


Temperatura de encolhimento

Em todas as amostras, a temperatura foi superior a 82ºC (valor considerado adequado para o pericárdio bovino fixado), independente da dose de radiação empregada.

Comportamento mecânico

Ocorreram alterações significativas no comportamento mecânico dos tecidos irradiados que apresentaram maiores deformações e menores resistências, quando comparados ao grupo controle. As curvas tensão x deformação representativas de cada grupo são apresentadas na Figura 3.


Fig. 3 - Atividade hidrolítica da enzima fosfatase alcalina em solução aquosa em função da dose de radiação gama empregada (n = 5).


Análise mineral

Não foi observada redução nos níveis de cálcio nas amostras irradiadas e houve um aumento significativo do conteúdo de Ca2+ nas amostras submetidas à dose de 10000 Gy, quando comparadas ao grupo controle (p < 0,05). Os resultados quantitativos de Ca2+ obtidos nas amostras dos diversos grupos, pré e pós-implante, são apresentados na Tabela 1.



DISCUSSÃO

Existem poucos relatos sobre os efeitos da radiação gama no colágeno, a maioria restrita ao colágeno fresco.

Cassel [17], empregando doses de 5 a 220 x 104 JKg-1, em pele bovina e tendão de cauda de canguru, observou decréscimo na temperatura de encolhimento e aumento na solubilidade e concluiu que a radiação gama causa a quebra das cadeias peptídicas.

Bowes e Moss [18] estudaram os efeitos da radiação gama no colágeno purificado obtido da cauda de bois. No colágeno irradiado em estado seco, observaram acentuada alteração na resistência à tração, mesmo em baixas doses, redução na temperatura de encolhimento e aumento na solubilidade. No colágeno irradiado em solução, observaram temperatura de encolhimento acima de 100 ºC e discreto efeito na solubilidade.

Os efeitos da radiação gama na estrutura do colágeno tratado com glutaraldeído foram descritos por Grant et al. [19], que observaram uma marcante proteção contra os efeitos destrutivos da radiação gama com doses de até 25 x 104 JKg-1 pela microscopia eletrônica.

Hafeez et al. [20] estudaram as propriedades mecânicas do pericárdio bovino fresco submetido a radiação gama na dose de 25 kGy e observaram alterações nas propriedades mecânicas do tecido, com diminuição significativa na sua resistência.

Na nossa investigação, a fosfatase alcalina em solução aquosa mostrou-se altamente radiosensível e, embora o seu comportamento enzimático frente à radiação gama não tenha sido descrito anteriormente, os resultados obtidos eram esperados, visto que a inibição da atividade de outras enzimas com o emprego da radiação gama encontra-se descrita na literatura [21,22].

A integridade estrutural do colágeno fixado nas amostras pré-implante não foi alterada com o emprego de radiação gama, entretanto, houve uma alteração significativa no comportamento mecânico do tecido irradiado, quando comparado ao grupo controle, mesmo com o emprego de baixas doses de radiação. As deformações foram maiores e as resistências mecânicas menores do que as observadas no grupo controle e não proporcionais às doses empregadas.

Apesar da acentuada radiosensibilidade da enzima fosfatase alcalina, com redução na sua atividade inicial superior a 98%, na dose de 5000 Gy, não houve redução da calcificação no tecido irradiado e, na dose de 10000 Gy, houve aumento significativo dos níveis de Ca2+ (362,61 ± 20,27 mg/mg x 194,45 ± 19,50 mg/mg no grupo controle).

Embora os dados obtidos em uma solução aquosa da enzima pura não possam ser automaticamente transportados para o tecido fixado, pode-se inferir que a radiação gama não se comportou como um agente anticalcificante no pericárdio bovino tratado com glutaraldeído.

CONCLUSÕES

O emprego da radiação gama no pericárdio bovino tratado com glutaraldeído resultou em elevação dos níveis de Ca2+ em implantes subcutâneos em ratos por quatro meses e promoveu uma alteração significativa no comportamento mecânico do tecido, com redução na sua resistência, quando comparados ao grupo controle.

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